Novel antimicrobial peptides from Zymomonas mobilis for treatment of skin and soft tissue infections (1.1.1.1/19/A/097)

2023.g. I ceturksnis
2023.g. I ceturksnī ir iesniegta un akceptēta publijkācija par izstrādāto antimikrobiālo peptīdu pielietojumu ādas un mīksto audu infekciju ārstēšanai MDPI izdevumam Antibiotics. Publikācija: Ramata-Stunda, A.; Boroduskis, M.; Kaktina, E.; Patetko, L.; Kalnenieks, U.; Lasa, Z.; Rubina, M.; Strazdina, I.; Kalnins, G.; Rutkis, R. Comparative Evaluation of Existing and Rationally Designed Novel Antimicrobial Peptides for Treatment of Skin and Soft Tissue Infections. Antibiotics 2023, 12, 551. https://doi.org/10.3390/ antibiotics12030551 Ir pabeigta R10 ekspresijas un attīrīšanas metodikas izstrāde, kas ir pielietojama kā E. coli tā Z. mobilis producēto peptīdu attīrīšanai. Ar masspektrometrijas metodi gūts apstiprinājums pruducētā un pēcāk attīrītā peptīda atbilstībai ķīmiski sintētiskajam analogam. Tika turpināts darbs pie mērogošanas un optimizācijas eksperimentiem paaugstinātas Z. mobilis biomasas ieguvei optimālākai peptīdu producēšanai. Ir uzsākts darbs pie publikācijas sagatvošanas par Z. mobilis paaugstināto rezistenci pret antimikrobiālajiem peptīdiem. 31.03.2023.

2022 In the IV quarter, work is continued/completed on the optimization of the expression system of the selected Z. mobilis strain (Zm6) for production of antimicrobial peptides by introducing the LacUV and T7 promoter systems. Work continued on the optimization of the method for the extraction and purification of the produced peptide R10 (sequence KKIAKKFWKKFWKFWKIFKK) by the gel filtration method in order to reduce the amount of conjugate formation. The activities of the expressed peptides are compared with the activities of the control samples against the selected ESCAPE bacterial strains. The obtained results (i) were presented at the European Biotechnology Congress 2022, 5-7 October in Prague, Czech Republic (stand report), (ii) are being compiled for publication in MDPI’s Antibiotics. To characterize the activity of the peptides selected for production, the study of their action mechanisms was successfully carried out using the fluorescent marker FITC and the confocal microscopy method. As a result, the membranotropic nature of the produced peptides was confirmed. The results obtained are being compiled for publication in MDPI’s Antibiotics. Work on cytotoxicity determination of expressed peptides has been completed. Results are being compiled for publication in MDPI’s Antibiotics. In addition, experiments have been planned and preparatory work for determining the hemolytic activity of peptides has been completed to be done in the 1st quarter of 2023. Scaling and optimization experiments were carried out with the aim of obtaining an increased amount of Z. mobilis biomass for more optimal peptide production. To avoid the formation of toxic intermediates, an algorithm for changing the aeration conditions for cultivation in the pre-production phase has been developed and is being tested.

2022.g. IV ceturksnī tiek turpināts/pabeigts darbs pie izvēlētā Z. mobilis celma (Zm6) ekspresijas sistēmas optimizācijas antimikrobiālo peptīdu producēšanai ieviešot LacUV un T7 promotera sistēmas. Turpināts darbs pie metodes optimizācijas producējamā peptīda R10 (sekvence KKIAKKFWKKFWKFWKIFKK) ekstrakcijai un attīrīšanai ar gēlfiltrācijas metodi, lai samazinātu konjugātu veidošanās apjomu. Ekspresēto peptīdu aktivitātes tiek salīdzinātas ar kontroles paraugu aktivitātēm pret izvēlētajiem ESCAPE baktēriju celmiem. Iegūtie rezultāti (i) tika prezentēti European Biotechnology Congress 2022,  5-7 Oktobrī Prāgā, Čehija (stenda ziņojums), (ii) tiek apkopoti publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Producēšanai izvēlēto peptīdu darbības raksturošanai tika sekmīgi īstenota to darbības mehanismu izpēte izmantojot fluoriscento iezīmi FITC un konfokālo mikroskopijas metodi. Rezultātā tika apstiprināta producējamo peptīdu membranatropā daba. Iegūtie rezultāti tiek apkopoti publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Ir pabeigts darbs pie ekspresējamo peptīdu citotoksicitātes noteikšanas. Rezultāti tiek apkopoti  publicēšanai MDPI  izdevumā Antibiotics. Papildus ir izplānoti eksperimenti un pabeigts sagatavošanas darbs peptīdu hemolītiskās  aktivitātes noteikšanai 2023 gada 1 ceturksnī. Tika īstenoti mērogošanas  un optimizācijas  eksperimenti ar mērķi iegūt paaugstinātu Z. mobilis biomasas daudzumu optimālākai peptīdu producēšanai. Lai izvairītos no toksisku starpproduktu veidošanās ir izstrādāts un tiek testēts algoritms aerācijas apstākļu maiņai kultivēšanai pirmsprodukcijas fāzē.

Continued work on the improvement of the peptide expression system in Z. mobilis: (i) new peptide and conjugated protein constructs were created, (ii) a green fluorescent protein (GFP)-based expression vector system was created for simplified evaluation and optimization of promoter efficiency.
For the selection of the best peptide candidates, a Langmuir-Blodgett experimental system designed for the study of the interaction between peptides and bacterial membranes has been established. The application of the equipment will ensure the acquisition of quantitative interaction data for their further complementation with already determined antimicrobial activities of peptides against different species of bacteria.

Prepared and submitted material for participation in the European Biotechnology Congress in the Czech Republic in Prague in October 2022.

Turpināts darbs pie peptīdu ekspresijas sistēmas pilnveides Z. mobilis: (i) izveidoti jauni peptīdu un konjugēto proteīnu konstrukti, (ii) izveidota uz zaļā fluoriscējošā proteīna (GFP) bāzēta ekspresijas vektoru sistēma promotera efektivitātes vienkāršotai novērtēšanai un optimizācijai.
Labāko petīdu kandidātu atlasei ir izveidota Langmuir-Blodgett eksprerimentālā iekārta, kas paredzēta peptīdu un baktēriju membrānu mijiedarbības pētījumiem. Iekārtas pielietošana nodrošinās kvantitatīvu mijiedrbības datu ieguvi to tālākai komplimentācijai ar jau noteiktajām peptīdu  antimikrobiālajām aktivitātēm pret dažādu sugu baktērijām.

Sagatavots un iesniegts materiāls dalībai Eiropas Biotehnoloģijas kongresam Čehijā Prāgā  2022 oktobrī.

Within the 1st  stage of the project, we have started design and characterization of different chemically synthesized AMPs, with subsequent expression of the most promising candidatesin Z. mobilis and E. coli. Activity of 14 novel antimicrobial peptides against the library of ESKAPE pathogens has been tested, and partly they have been expressed in Z. mobilis. In parallel, the Z. mobilis levan anti-inflammatory properties were tested in peripheral blood mononuclear cells for their potential to induce secretion of pro- and anti-inflammatory cytokines. Seven of the 14 synthesized peptides were selected on the basis of existing evidence of their activity against ESKAPE pathogens, while the other half were novel, rationally designed, hybrid peptides developed by the project team member. So far out of the 7 peptides tested most promising peptide RP556 [W. Woodburn et al (2020) Antibiotics 2020, 9, 23] showed low cytotoxicity against mammalian cells, while having high antimicrobial activity against all ESKAPE pathogens examined, but not against Z. mobilis. Furthermore, the RP556 peptide fused with GFOR periplasmic signalling sequence and TEV protease linker, recently has been expressed in Z. mobilis. The peptide was present not only in Z. mobilis cell lysates, but also in the culture medium, which is potentially beneficial for following downstream processing.

During the first half of the project, we have gathered evidence showing the high potential of Z. mobilis levan to modulate secretion of pro- and anti-inflammatory cytokines.

Pašreizējā projekta posmā ir uzsākta dažādu jaunu, ķīmiski sintezētu AMP izstrāde un raksturošana ar mērķi perspektīvākos kandidātus ekspresēt Z. mobilis un E. coli šūnās. Septiņi no 14 sintezētajiem peptīdiem tika izvēlēti, pamatojoties uz literatūrā pieejamiem datiem par to aktivitāti pret ESKAPE grupas patogēniem, savukārt, 7 bija jauni, projekta grupas dalībnieku racionāli izstrādāti peptīdi. Līdz šim no 7 pārbaudītajiem peptīdiem visdaudzsološākais peptīds RP556 [W. Woodburn et al (2020) Antibiotics 2020, 9, 23] uzrādīja zemu citotoksiskumu zīdītāju šūnām, vienlaikus nodrošinot augstu antibakteriālo aktivitāti pret visiem ESKAPE patogēniem, bet ne pret Z. mobilis. Paralēli jaunu peptīdu antimikrobiālo īpāšību izvērtēšanai perifērās asins mononukleārās šūnās tika novērtētas Z. mobilis producētā levāna pretiekaisuma īpašības, parādot Z. mobilis levāna pozitīvo lomu  pretiekaisuma citokīnu sekrēcijā. Turklāt RP556 peptīdi, kas papildināti ar GFOR periplasmatisko signālsekvenci un TEV proteāzes linkeri, ir sekmīgi ekspresēti Z. mobilis šūnās. Līdzšinējie rezultāti netieši parāda RP556 peptīda klātbūtni ne tikai  Z. mobilis šūnu lizātos, bet arī kultūras barotnē, kas ir īpaši noderīgi pēcapstrādes procesā, kombinējot peptīdu antimikrobiālās un levāna imunomodulējošās īpašības pielietojama gala produkta veidošanā.

Pirmajā projekta izpildes pusē esam ieguvuši pierādījumus, kas norāda uz augsto Z. mobilis levāna potenciālu modulēt pro- un pretiekaisma citokīnu sekrēciju.

The project “New antimicrobial peptides derived from Zymomonas mobilis for use in the treatment of skin and soft tissue infections” completed the identification of active antimicrobial compounds of the piw Z.mobilis strain ATCC 10988. It has been experimentally confirmed that the antimicrobial activity of Z. mobilis is mainly due to the presence of synthesized organic acids, mainly propionate and acetate, in the mM concentration in fraction of the supernatant. Further analysis of the most chromatographically active fractions of the supernatant did not confirm the possible presence of peptides in providing antimicrobial activity. These results are summarized in a report submitted for publication in the journal Fermentation Impact Factor: 3,975 (2020).

The stimulatory effect of Levan, a polysaccharide in the Z. mobilis supernatant fraction, on the secretion of peripheral blood mononuclear cell cytokines IL-6, IL-8 and TNF-α has been demonstrated. Low cytotoxicity of levan has been shown in skin keratinocyte and dermal fibroblast cultures. The results to date highlight the potential use of the supernatant in the treatment and prevention of skin and mucosal wounds and inflammation.

The continuation of the project envisages the expression of heterologous antimicrobial peptides Z. mobilis, which, synergistically interacting with the immunomodulatory and antimicrobial properties of the synthesized levan, would allow the supernatant lyophilized material to be used in the treatment of skin and soft tissue infections. To characterize the immunomodulatory effect, additional experiments have been initiated in vitro to induce inflammation in cell cultures.

Projektā “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” pabeigts darbs  piw Z.mobilis celma ATCC 10988 aktīvo antimikrobiālo savienojumu identificēšanas. Eksperimentāli ir ticis apstiprināts, ka Z. mobilis antimikrobiālo aktivitāti pamatā nodrošina sintezēto organisko skābju, galvenokārt propionāta un acetāta, klātbūtne supernatanta frakcijā mM koncentrācijā. Papildus analizējot supernatanta aktīvāko hromatogrāfiski iegūto frakciju īpašības netika gūts apstiprinājums iespējamai peptīdu klātbūtnei antimikrobiālās aktivitātes nodrošināšanā. Minētie rezultāti ir apkopoti ziņojumā, kas iesniegts publicēšanai žurnālā “Fermentation” Impakta faktors: 3.975 (2020).

Ir tikusi parādīta Z. mobilis supernatanta frakcijā esošo polisaharīdu Levānu stimulējošā ietekme uz perifēro asiņu mononukleāro šūnu citokīnu IL-6, IL-8 un TNF-α sekrēciju. Ādas keratinocītu un dermas fibroblastu kultūrās parādīta levāna zemā citotoksicitāte. Līdzšinējie rezultāti iezīmē supernatanta potenciālu pielietojumu ādas un gļotādas brūču un iekaisumu terapijā un  profilaksē.

Projekta turpinājumā ir paredzēta heterologa antimikrobiālu peptīdu ekspresija Z. mobilis, kas sinerģiski mijiedarbojoties ar sintezētā levāna imūnmodulējošām un organisko skābju antimikrobiālajām īpašībām, supernatanta liofilizēto materiālu ļautu pielietot ādas un mīksto audu infekciju terapijā. Imunomodulējošās iedarbības raksturošanai uzsākti papildus eksperimenti in vitro šūnu kultūrās inducējot iekaisumu.

Safety and efficacy evaluation of Z. Mobilis supernatants containing antimicrobial agents has been initiated. When testing the cytotoxicity of a fractionated 20x concentrated sample according to the OECD TG 129 guidelines in the mouse embryonic fibroblast line Balb / c 3T3, the IC50 of the tested sample was calculated to be 4.57%. Tested concentration range: 0.078-10.0%. The difference in solvents (buffer) is statistically significant: p = 0.0266 (t-test).

Work has begun on creating room for basic scaling parameters to increase the synthesis of propionate and acetate under aerobic conditions while maintaining high levan synthesis.

Turpināta antimikrobiālās aktivitātes analīze šķidrajās kultūrās pētot celmu ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pret ESKAPE patogēniem – Z. mobilis ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka anaerobi audzētām kultūrām  nonākot aerobos apstāķļos antimikrobiālā aktivitāte ir augstāka, kā pilnībā kultivējot šūnas aerobi, kas netieši norāda uz ar antimikrobiālu efektu saistīto enzīmu ekspresijas līmeņa atšķirību.

Uzsākts drošuma un efektivitātes novērtējums antimikrobiālos aģentus saturošiem Z. Mobilis supernatantiem. Testējot frakcionēts 20x koncentrēts paraugs citotoksicitāti, pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, testētajam paraugam IC50 aprēķināts 4.57%. Testētais koncentrāciju diapazons: 0.078-10.0%. Atšķirība no šķīdinātāja (bufera) ir statistiski nozīmīga: p=0.0266 (t tests).

Uzsākts darbs pie mērogošanas pamatparametru telpas izveides lai palielinātu propionāta un acetāta sintēzi aerobos apstākļos vienlaikus saglabājot augstu levāna sintēzi.

Projektā “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” turpināts darbs ar Z.mobilis celma ATCC 10988 kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas materiāla testēšana pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni). Uzsākts darbs arī pie antimikrobiālā efekta noteicošā savienojuma identifikācijas ar masspektrometrijas un kodolmagnētiskās rezonanses metodēm. Frakcionētajam materiālam ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pēc iekoncentrēšanas uzsākta citotoksicitātes izvērtēšana pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, koncentrācijās no 0.078 – 10.0%. Testētajam paraugam tiks noteikts arī IC50, salīdzinot ar šķīdinātāju. Antimikrobiālo savienojumu saturošās frakcijas citotoksicitātes izvērtējums ir būtisks priekšnosacījums tālākai imunomudulāro īpašību izvērtēšanai, kas paredzēta projekta turpinājumā.

Projekta “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” realizācijas laikā  tika sekmīgi pierādīta baktēriju Z. mobilis  spēja vidē sekretēt savienojumus ar augstu antimikrobiālo aktivitāti pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni).  Analizējot Z.mobilis celmus tika konstatēts, ka augstākā antimikrobiālā aktivitāte pret ESKAPE patogēniem piemīt celmam ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka tā  saglabājas tikai Z. mobilis baktērijas kultivējot aerobos apstāķļos, kas netieši norāda uz antimikrobiālā efekta saistību ar mikroorganismu aerobo metabolismu. Z. mobilis kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas rezultātā izdevās noskaidrot, ka antimikrobiālo efektu noteicošais savienoijums ir termostabils līdz 90 grādiem celsija, ir labi ūdenī šķīstošs un mazāks par 3000 Da. Tālākai tā identifikācijai tiks izmantotas masspektometrijas un kodolmaknētiskās rezonanses metodes.

Zymomonas mobilis is an unusual facultatively anaerobic Gram-negative bacterium, possessing antimicrobial activity against various ESKAPE (Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas and Enterobacter species) pathogens, fungi and even protists. According to earlier reports, largely this might be attributed to some extracellular peptides synthesized by Z. mobilis. However, the genome analysis of Z. mobilis does not indicate any significant homologies with AMP(s) sequences of taxonomically closely related alpha-proteobacteria, and, furthermore, Z. mobilis cultures do not reveal presence of any of previously characterized AMP(s). These results in combination with the reported activity against broad spectrum of ESKAPE pathogens makes Z. mobilis a promising candidate for discovery of novel AMP(s).

Objective

The characterization and production of novel antimicrobial peptides from Z. mobilis for treatment of skin and soft tissue infections.

Activities

1. Screening of the Z. mobilis strains for the highest antimicrobial activity against selected ESKAPE strains.
2. Fractionation of the AMP(s) produced by Z. mobilis.
3. Screening of the specific activity of the fractionated AMP(s) against library of ESKAPE pathogens.
4. Characterization of the AMP(s) produced by Z. mobilis.
5. Safety and efficacy evaluation of the selected AMP fractions.
6. Scaling of production and purification of AMP fractions and AMP(s).

Results

1. Experimental protocol, defining particular Z. mobilis producing the highest inhibitory activity of the extracellular medium strain with its specified culture conditions.
2. Experimental protocol for the fractionation of the bacterial medium by chromatography and density gradient centrifugations.
3. 3 manuscripts of original scientific articles in a SCOPUS/WoS indexed journals, the citation index of which reaches at least 50 percent of the average citation index in the field.
4. Experimental protocol, describing scale-up and purification process of a new product – Z. mobilis AMP(s).

Duration: 1st of October 2020 – 30th of September 2023
Leading partner: University of Latvia
Partners: University of Latvia, SIA “Alternative Plants”
Project scientific manager: UL leading researcher Dr. Reinis Rutkis, reinis.rutkis@lu.lv
Funded by: European Regional Development Fund, as a part of 1.1.1.1 measure “Support for applied research” and specific objective 1.1.1 “Improve research and innovation capacity and the ability of Latvian research institutions to attract external funding, by investing in human capital and infrastructure”, Nr. 1.1.1.1/19/A/075 and project partners.
Total budget: 601 160,42 EUR

Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā

Ādas un mīksto audu infekcijas (ĀMAI) ir vienas no cilvēku vidū visvairāk izplatītajām bakteriālajām infekcijām. ĀMAI izraisošās baktērijas uzrāda pieaugošu rezistenci pret parasti lietotajām antibiotikām, un šobrīd tā ir viena no vadošajām nozokomiālu patogēnu kategorijām. Tā kā antimikrobiālie peptīdi (AMP) aktīvi iedarbojas uz dažādiem baktēriju un sēnīšu celmiem, kuri izraisa ādas un mīksto audu infekcijas, tie tiek uzskatīti par pamatotu alternatīvu tradicionālajai ārstēšanai ar antibiotikām. ĀMAI uzskatāmas par īpaši pievilcīgu mērķi AMP pielietojumam tieši lokālai ārstēšanai, jo lokāls pielietojums ļauj izvairīties no potenciālas nelabvēlīgas sistēmiskās ietekmes un ļauj mērķa zonā sasniegt augstas medikamentu koncentrācijas. Tāpēc jaunu AMP ražotāju atrašanai ir ievērojama praktiska nozīme.

Zymomonas mobilis ir neparasta fakultatīvi anaeroba Gram-negatīva baktērija, kurai raksturīga antimikrobiāla iedarbība uz dažādiem ESKAPE (Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas un Enterobacter sugas) patogēniem, sēnītēm un pat protistiem. Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem, tas lielā mērā varētu būt saistīts ar dažiem Z. mobilis sintezētiem āršūnu antimikrobiālajiem peptīdiem. Tomēr Z. mobilis genoma analīze neuzrāda nozīmīgas homoloģijas ar taksonomiski cieši saistītām alfa-proteobaktēriju antimikrobiālo peptīdu sekvencēm, turklāt Z. mobilis kultūrās nav atklāts neviens no iepriekš raksturotajiem AMP. Šie rezultāti apvienojumā ar zināmo Z. mobilis iedarbību uz plašu ESKAPE patogēnu spektru padara Z. mobilis par daudzsološu kandidātu jaunu AMP atklāšanai.

Mērķis

No Zymomonas mobilis iegūtu jaunu antimikrobiālo peptīdu raksturošana un producēšana pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā.

Aktivitātes

1. Z. mobilis celma ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pret ESKAPE ptogēniem noteikšana.
2. Ar Z. mobilis saražotā(-o) AMP frakcionēšana.
3. Frakcionēto AMP specifiskās darbības pārbaude attiecībā pret ESKAPES patogēnu bibliotēku.
4. Ar Z. mobilis radīto AMP raksturojums.
5. Izvēlēto AMP frakciju drošuma un efektivitātes novērtējums.
6. AMP ražošanas un attīrīšanas apjoma palielināšana.

Rezultāti

1. Eksperimentālais protokols, definējot
   konkrētu Z. mobilis, kas rada visaugstāko ekstracelulārās vides celma inhibējošo aktivitāti ar tā noteiktajiem kultūras apstākļiem.
2. Eksperimentālais protokols baktēriju barotnes frakcionēšanai hromatogrāfiski un ar blīvuma gradienta centrifugēšanas metodēm.
3. 3 oriģinālu zinātnisku rakstu manuskripti SCOPUS/WoS indeksētajos žurnālos, kuru citātu indekss sasniedz vismaz 50 procentus no vidējās citējamības.
4. Eksperimentālais protokols, kurā aprakstīts jauna produkta mērogošanas un attīrīšanas process – Z. mobilis AMP.

Projekta norise: 2020. gada 1. oktobris – 2023. gada 30. septembris
Vadošais partneris: Latvijas Universitāte
Parteri: Latvijas Universitāte, SIA “Alternative Plants”
Projekta zinātniskais vadītājs: Latvijas Universitātes vadošais pētnieks Dr. Reinis Rutkis.
Projekta finansētājs: Eiropas Reģionālās attīstības fonda (ERAF), darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” Nr. 1.1.1.1/19/A/075
Projekta kopējais finansējums: 601 160,42 EUR.