info@alternativeplants.eu

Projects

Novel antimicrobial peptides from Zymomonas mobilis for treatment of skin and soft tissue infections (1.1.1.1/19/A/097)

Dec 22, 2021

The project “New antimicrobial peptides derived from Zymomonas mobilis for use in the treatment of skin and soft tissue infections” completed the identification of active antimicrobial compounds of the piw Z.mobilis strain ATCC 10988. It has been experimentally confirmed that the antimicrobial activity of Z. mobilis is mainly due to the presence of synthesized organic acids, mainly propionate and acetate, in the mM concentration in fraction of the supernatant. Further analysis of the most chromatographically active fractions of the supernatant did not confirm the possible presence of peptides in providing antimicrobial activity. These results are summarized in a report submitted for publication in the journal Fermentation Impact Factor: 3,975 (2020).

The stimulatory effect of Levan, a polysaccharide in the Z. mobilis supernatant fraction, on the secretion of peripheral blood mononuclear cell cytokines IL-6, IL-8 and TNF-α has been demonstrated. Low cytotoxicity of levan has been shown in skin keratinocyte and dermal fibroblast cultures. The results to date highlight the potential use of the supernatant in the treatment and prevention of skin and mucosal wounds and inflammation.

The continuation of the project envisages the expression of heterologous antimicrobial peptides Z. mobilis, which, synergistically interacting with the immunomodulatory and antimicrobial properties of the synthesized levan, would allow the supernatant lyophilized material to be used in the treatment of skin and soft tissue infections. To characterize the immunomodulatory effect, additional experiments have been initiated in vitro to induce inflammation in cell cultures.

Projektā “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” pabeigts darbs  piw Z.mobilis celma ATCC 10988 aktīvo antimikrobiālo savienojumu identificēšanas. Eksperimentāli ir ticis apstiprināts, ka Z. mobilis antimikrobiālo aktivitāti pamatā nodrošina sintezēto organisko skābju, galvenokārt propionāta un acetāta, klātbūtne supernatanta frakcijā mM koncentrācijā. Papildus analizējot supernatanta aktīvāko hromatogrāfiski iegūto frakciju īpašības netika gūts apstiprinājums iespējamai peptīdu klātbūtnei antimikrobiālās aktivitātes nodrošināšanā. Minētie rezultāti ir apkopoti ziņojumā, kas iesniegts publicēšanai žurnālā “Fermentation” Impakta faktors: 3.975 (2020).

Ir tikusi parādīta Z. mobilis supernatanta frakcijā esošo polisaharīdu Levānu stimulējošā ietekme uz perifēro asiņu mononukleāro šūnu citokīnu IL-6, IL-8 un TNF-α sekrēciju. Ādas keratinocītu un dermas fibroblastu kultūrās parādīta levāna zemā citotoksicitāte. Līdzšinējie rezultāti iezīmē supernatanta potenciālu pielietojumu ādas un gļotādas brūču un iekaisumu terapijā un  profilaksē.

Projekta turpinājumā ir paredzēta heterologa antimikrobiālu peptīdu ekspresija Z. mobilis, kas sinerģiski mijiedarbojoties ar sintezētā levāna imūnmodulējošām un organisko skābju antimikrobiālajām īpašībām, supernatanta liofilizēto materiālu ļautu pielietot ādas un mīksto audu infekciju terapijā. Imunomodulējošās iedarbības raksturošanai uzsākti papildus eksperimenti in vitro šūnu kultūrās inducējot iekaisumu.


Sep 21, 2021

The analysis of the antimicrobial activity in liquid cultures is continued by studying the strain with the highest antimicrobial activity against ESKAPE pathogens – Z. mobilis ATCC 10988. When studying the dependence of Z. mobilis antimicrobial activity on culture conditions, it was found that anaerobic cultures under aerobic  conditions have higher antimicrobial activity than culturing cells aerobically, which indirectly indicates a difference in the expression level of enzymes associated with the antimicrobial effect.

Safety and efficacy evaluation of Z. Mobilis supernatants containing antimicrobial agents has been initiated. When testing the cytotoxicity of a fractionated 20x concentrated sample according to the OECD TG 129 guidelines in the mouse embryonic fibroblast line Balb / c 3T3, the IC50 of the tested sample was calculated to be 4.57%. Tested concentration range: 0.078-10.0%. The difference in solvents (buffer) is statistically significant: p = 0.0266 (t-test).

Work has begun on creating room for basic scaling parameters to increase the synthesis of propionate and acetate under aerobic conditions while maintaining high levan synthesis.

Turpināta antimikrobiālās aktivitātes analīze šķidrajās kultūrās pētot celmu ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pret ESKAPE patogēniem – Z. mobilis ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka anaerobi audzētām kultūrām  nonākot aerobos apstāķļos antimikrobiālā aktivitāte ir augstāka, kā pilnībā kultivējot šūnas aerobi, kas netieši norāda uz ar antimikrobiālu efektu saistīto enzīmu ekspresijas līmeņa atšķirību.

Uzsākts drošuma un efektivitātes novērtējums antimikrobiālos aģentus saturošiem Z. Mobilis supernatantiem. Testējot frakcionēts 20x koncentrēts paraugs citotoksicitāti, pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, testētajam paraugam IC50 aprēķināts 4.57%. Testētais koncentrāciju diapazons: 0.078-10.0%. Atšķirība no šķīdinātāja (bufera) ir statistiski nozīmīga: p=0.0266 (t tests).

Uzsākts darbs pie mērogošanas pamatparametru telpas izveides lai palielinātu propionāta un acetāta sintēzi aerobos apstākļos vienlaikus saglabājot augstu levāna sintēzi.


Jun 17, 2021

The project “Novel antimicrobial peptides from Zymomonas mobilis for treatment of skin and soft tissue infections” continued work with Z.mobilis strain ATCC 10988 culture material with high antimicrobial activity testing of fractionation material of culture medium with high antimicrobial activity against microorganisms studied in the project, which cause infectious diseases of skin and soft tissues (pathogens of ESKAPE group). Work has also begun on the identification of the antimicrobial effect determining compound by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance methods. For the fractionated material with the highest antimicrobial activity after concentration, the evaluation of cytotoxicity was started according to the OECD TG 129 guidelines in the mouse embryonic fibroblast line Balb/c 3T3, in concentrations from 0.078 – 10.0%. The sample will also be tested for IC50 comparing against solvent. Evaluation of the cytotoxicity of the antimicrobial activity containing fraction is an essential precondition for further evaluation of the immunomodulatory properties which will be tested in the continuation of the project.

Projektā “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” turpināts darbs ar Z.mobilis celma ATCC 10988 kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas materiāla testēšana pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni). Uzsākts darbs arī pie antimikrobiālā efekta noteicošā savienojuma identifikācijas ar masspektrometrijas un kodolmagnētiskās rezonanses metodēm. Frakcionētajam materiālam ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pēc iekoncentrēšanas uzsākta citotoksicitātes izvērtēšana pēc OECD TG 129 vadlīnijām peļu embrionālo fibroblastu līnijā Balb/c 3T3, koncentrācijās no 0.078 – 10.0%. Testētajam paraugam tiks noteikts arī IC50, salīdzinot ar šķīdinātāju. Antimikrobiālo savienojumu saturošās frakcijas citotoksicitātes izvērtējums ir būtisks priekšnosacījums tālākai imunomudulāro īpašību izvērtēšanai, kas paredzēta projekta turpinājumā.


Mar 26, 2021

The project “Novel antimicrobial peptides from Zymomonas mobilis for treatment of skin and soft tissue infections” successfully demonstrated the ability of bacteria Z. mobilis to secrete compounds with high antimicrobial activity in the environment against the microorganisms to be studied in the project that cause infectious diseases of the skin and soft tissues (pathogens of the ESKAPE group). The analysis of Z.mobilis strains revealed that the highest antimicrobial activity against ESKAPE pathogens is present in the strain ATCC 10988. When studying the dependence of Z. mobilis antimicrobial activity on culture conditions, it was found that it remains only when Z. mobilis bacteria are cultured under aerobic conditions, which indirectly indicates the association of antimicrobial effect with aerobic metabolism of microorganisms. As a result of fractionation of Z. mobilis culture medium with high antimicrobial activity, it was found that the antimicrobial compound is thermostable up to 90 degrees Celsius, well soluble in water and less than 3000 Da. Mass spectrometry and nuclear magnetic resonance techniques will be used for further analyses.

Projekta “Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā” realizācijas laikā  tika sekmīgi pierādīta baktēriju Z. mobilis  spēja vidē sekretēt savienojumus ar augstu antimikrobiālo aktivitāti pret projektā pētāmiem mikroorganismiem, kas izraisa ādas un mīksto audu infekcijas slimības (ESKAPE grupas patogēni).  Analizējot Z.mobilis celmus tika konstatēts, ka augstākā antimikrobiālā aktivitāte pret ESKAPE patogēniem piemīt celmam ATCC 10988. Pētot Z. mobilis antimikrobiālās aktivitātes atkarību no kultivēšanas apstāķļiem, tika konstatēts, ka tā  saglabājas tikai Z. mobilis baktērijas kultivējot aerobos apstāķļos, kas netieši norāda uz antimikrobiālā efekta saistību ar mikroorganismu aerobo metabolismu. Z. mobilis kultūrvides ar augstu antimikrobiālo aktivitāti frakcionēšanas rezultātā izdevās noskaidrot, ka antimikrobiālo efektu noteicošais savienoijums ir termostabils līdz 90 grādiem celsija, ir labi ūdenī šķīstošs un mazāks par 3000 Da. Tālākai tā identifikācijai tiks izmantotas masspektometrijas un kodolmaknētiskās rezonanses metodes.


Oct 1, 2020

Skin and soft tissue infections (SSTIs) rank among the most widespread bacterial infections in humans. Bacteria causing SSTI(s) show an increasing resistance against commonly used antibiotics, and currently represent one of the leading categories of nosocomial pathogens. Due to their activity against various bacteria and fungi strains that cause skin and soft tissue infections, antimicrobial peptides (AMPs) are considered as a feasible alternative to the traditional antibiotic therapy. Particularly, SSTIs represent an attractive target for the application of AMP(s) for topical treatment, since topical application circumvents potential systemic adverse effects and allows to achieve high drug concentrations at the target site. Therefore, finding novel producers of AMP(s) is of considerable practical interest.

Zymomonas mobilis is an unusual facultatively anaerobic Gram-negative bacterium, possessing antimicrobial activity against various ESKAPE (Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas and Enterobacter species) pathogens, fungi and even protists. According to earlier reports, largely this might be attributed to some extracellular peptides synthesized by Z. mobilis. However, the genome analysis of Z. mobilis does not indicate any significant homologies with AMP(s) sequences of taxonomically closely related alpha-proteobacteria, and, furthermore, Z. mobilis cultures do not reveal presence of any of previously characterized AMP(s). These results in combination with the reported activity against broad spectrum of ESKAPE pathogens makes Z. mobilis a promising candidate for discovery of novel AMP(s).

Objective

The characterization and production of novel antimicrobial peptides from Z. mobilis for treatment of skin and soft tissue infections.

Activities

  1. Screening of the Z. mobilis strains for the highest antimicrobial activity against selected ESKAPE strains.
  2. Fractionation of the AMP(s) produced by Z. mobilis.
  3. Screening of the specific activity of the fractionated AMP(s) against library of ESKAPE pathogens.
  4. Characterization of the AMP(s) produced by Z. mobilis.
  5. Safety and efficacy evaluation of the selected AMP fractions.
  6. Scaling of production and purification of AMP fractions and AMP(s).

Results

  1. Experimental protocol, defining particular Z. mobilis producing the highest inhibitory activity of the extracellular medium strain with its specified culture conditions.
  2. Experimental protocol for the fractionation of the bacterial medium by chromatography and density gradient centrifugations.
  3. 3 manuscripts of original scientific articles in a SCOPUS/WoS indexed journals, the citation index of which reaches at least 50 percent of the average citation index in the field.
  4. Experimental protocol, describing scale-up and purification process of a new product – Z. mobilis AMP(s).


Duration: 1st of October 2020 – 30th of September 2023
Leading partner: University of Latvia
Partners: University of Latvia,
 SIA “Alternative Plants”
Project scientific manager: UL leading researcher Dr. Reinis Rutkis, reinis.rutkis@lu.lv
Funded by: European Regional Development Fund, as a part of 1.1.1.1 measure “Support for applied research” and specific objective 1.1.1 “Improve research and innovation capacity and the ability of Latvian research institutions to attract external funding, by investing in human capital and infrastructure”, Nr. 1.1.1.1/19/A/075 and project partners.
Total budget: 601 160,42 EUR

Jauni no Zymomonas mobilis iegūti antimikrobiālie peptīdi pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā

Ādas un mīksto audu infekcijas (ĀMAI) ir vienas no cilvēku vidū visvairāk izplatītajām bakteriālajām infekcijām. ĀMAI izraisošās baktērijas uzrāda pieaugošu rezistenci pret parasti lietotajām antibiotikām, un šobrīd tā ir viena no vadošajām nozokomiālu patogēnu kategorijām. Tā kā antimikrobiālie peptīdi (AMP) aktīvi iedarbojas uz dažādiem baktēriju un sēnīšu celmiem, kuri izraisa ādas un mīksto audu infekcijas, tie tiek uzskatīti par pamatotu alternatīvu tradicionālajai ārstēšanai ar antibiotikām. ĀMAI uzskatāmas par īpaši pievilcīgu mērķi AMP pielietojumam tieši lokālai ārstēšanai, jo lokāls pielietojums ļauj izvairīties no potenciālas nelabvēlīgas sistēmiskās ietekmes un ļauj mērķa zonā sasniegt augstas medikamentu koncentrācijas. Tāpēc jaunu AMP ražotāju atrašanai ir ievērojama praktiska nozīme.

Zymomonas mobilis ir neparasta fakultatīvi anaeroba Gram-negatīva baktērija, kurai raksturīga antimikrobiāla iedarbība uz dažādiem ESKAPE (Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas un Enterobacter sugas) patogēniem, sēnītēm un pat protistiem. Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem, tas lielā mērā varētu būt saistīts ar dažiem Z. mobilis sintezētiem āršūnu antimikrobiālajiem peptīdiem. Tomēr Z. mobilis genoma analīze neuzrāda nozīmīgas homoloģijas ar taksonomiski cieši saistītām alfa-proteobaktēriju antimikrobiālo peptīdu sekvencēm, turklāt Z. mobilis kultūrās nav atklāts neviens no iepriekš raksturotajiem AMP. Šie rezultāti apvienojumā ar zināmo Z. mobilis iedarbību uz plašu ESKAPE patogēnu spektru padara Z. mobilis par daudzsološu kandidātu jaunu AMP atklāšanai.

Mērķis

No Zymomonas mobilis iegūtu jaunu antimikrobiālo peptīdu raksturošana un producēšana pielietojumam ādas un mīksto audu infekciju terapijā.

Aktivitātes

  1. Z. mobilis celma ar augstāko antimikrobiālo aktivitāti pret ESKAPE ptogēniem noteikšana.
  2. Ar Z. mobilis saražotā(-o) AMP frakcionēšana.
  3. Frakcionēto AMP specifiskās darbības pārbaude attiecībā pret ESKAPES patogēnu bibliotēku.
  4. Ar Z. mobilis radīto AMP raksturojums.
  5. Izvēlēto AMP frakciju drošuma un efektivitātes novērtējums.
  6. AMP ražošanas un attīrīšanas apjoma palielināšana.

Rezultāti

  1. Eksperimentālais protokols, definējot
    konkrētu Z. mobilis, kas rada visaugstāko ekstracelulārās vides celma inhibējošo aktivitāti ar tā noteiktajiem kultūras apstākļiem.
  2. Eksperimentālais protokols baktēriju barotnes frakcionēšanai hromatogrāfiski un ar blīvuma gradienta centrifugēšanas metodēm.
  3. 3 oriģinālu zinātnisku rakstu manuskripti SCOPUS/WoS indeksētajos žurnālos, kuru citātu indekss sasniedz vismaz 50 procentus no vidējās citējamības.
  4. Eksperimentālais protokols, kurā aprakstīts jauna produkta mērogošanas un attīrīšanas process – Z. mobilis AMP.


Projekta norise: 2020. gada 1. oktobris – 2023. gada 30. septembris
Vadošais partneris: Latvijas Universitāte
Parteri: Latvijas Universitāte, SIA “Alternative Plants”
Projekta zinātniskais vadītājs: Latvijas Universitātes vadošais pētnieks Dr. Reinis Rutkis.
Projekta finansētājs: Eiropas Reģionālās attīstības fonda (ERAF), darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” Nr. 1.1.1.1/19/A/075
Projekta kopējais finansējums: 601 160,42 EUR.


Want to know more?

Subscribe to our newsletter to receive occasional updates on our company news and products.

Subscribe here